2025ano9mês, de várias instituições como a Faculdade de Pós-Graduação de Medicina da Universidade de Quioto em DermatologiaNaomi KitayamaA equipe de pesquisa, emPesquisa Bioquímica e Biofísica ComunicaçõesPublicado na revista com o títuloDirecionando PAR-2 na dermatite atópica: Avaliação pré-clínica do novo inibidor E6795Pesquisa. O estudo tem como foco a dermatite atópica (ADMecanismo patológico da ativação do receptor para a nova protease2（PAR-2Inibidores de pequenas moléculasE6795Uma avaliação pré-clínica foi realizada para determinar a melhoria.ADInflamação relacionada, coceira e disfunção da barreira da pele.

Resumo

Dermatite Atópica (ADÉ uma doença inflamatória crônica da pele caracterizada por lesões cutâneas semelhantes ao eczema, coceira intensa e perda da função de barreira da pele. Apesar do surgimento de novos tratamentos, muitos pacientes ainda enfrentam problemas como controle inadequado da doença, custos elevados de tratamento e recidiva. Protease ativa receptores2（PAR-2(EmADA expressão excessiva na lesão cutânea desempenha um papel na promoção da resposta inflamatória, na geração de coceira e no desequilíbrio epidérmico. Este estudo forneceE6795evidências de estudos pré-clínicos que o composto é uma pequena molécula projetada para visar os processos patológicos acima mencionadosPAR-2inibidores. Análises de quinases e farmacologia confirmam queE6795Supressão seletivaPAR-2Interações fora do alvo extremamente baixas foram mostradas em uma ampla gama de painéis de detecção de quinases e farmacologia. Além disso,E6795Melhorou em ambos os modelos de ratosADEndpoint relevantes, incluindo redução da resposta inflamatória e invasão das células imunológicas; A administração oral reduz a perda de água epidérmica (TEWL), e2%Os cremes locais melhoraram o desempenho histológico e os sintomas de coceira associados à função de barreira. O exame histológico confirmou,E6795A infiltração celular inflamatória diminui após o tratamento e a barreira da pele melhora. Os resultados da pesquisa indicam queE6795Através da supressão seletivaPAR-2Transmissão de sinal, efeito de alvoADTrês pilares da fisiopatologia——Disfunção da barreira, resposta inflamatória e coceira. Este estudo destacaE6795Como um novo modelo econômicoADO potencial de medicamentos de tratamento local.

ExperiênciaMateriais e instrumentos

a) Materiais experimentais

1. Animais de Experimento:11-12Masculino de idade semanalNc / Ngaratos,6-14Semana Idade FemininaBALB/cratos,6-10Masculino de idade semanalC57BL / 6JO rato.

2. Reagentes e anticorpos:MC903eE6795ePAR-2Peptídeos excitantesSLIGKV-NH8322ndle;eSLIGRL-NH ₂Panprotease, coagulase, carboximetilcelulose, dimetil-metano, uratano, vários anticorpos marcadores fluorescentes,FLIPRReagentes de cálcio, colagenaseIITipo,DNase I、10%Formalina, Sumica-Reagentes de coloração vermelha, metamina azul, etc.

3. amostras de células e tecidos: rins embrionários humanosO HEK293amostras de pele de pessoas saudáveis,ADamostras de pele danificadas do paciente.

2) Instrumentos experimentais

O FDSS6000Sistema de Detecção de Fluorescença,FACS FortessaCelulômetro de fluxo,O FlowJoSoftware, espessometros, sistemas de medição de arranhões,384Placa de armazenamento de reagentes de polipropileno poroso,EuTipo saco de colágeno é transparente fundo preto384Placas furadas, gaiolas de ventilação, microscópios e sistemas de análise de imagem,ASCHVaposcanMedidor de perda de água transcutânea

ASCH VAPOSCANMedidor de perda de água transcutânea

Processo experimental

1. Experimentos celulares:O HEK293As células contêm3%Soro de vaca fetalDMEMCultivado em meio, vacinado384Carga posterior do furoFLIPRReagentes de medição de cálcio com diferentes concentraçõesE6795pré-tratamento30minutos, depois adicionar a pancreatase ou coagulase, atravésO FDSS6000Monitoramento do sistema120Intensidade de fluorescência em tempo real em segundos com quatro parâmetroslogísticaCálculo do modeloIC₅₀Valor.

2. Construção e administração de modelos animais:

￮MC903induçãoADModelo:BALB/cOrelha contínua do rato8Aplicação local no diaMC903A partir da4Oral diariamenteE6795A mistura de carboximetilcelulose foi administrada ao grupo de controle com o solvente correspondente.

￮Nc / NgaGraveADModelo: Vai sofrer de dermatiteNc / NgaRatos divididos em5Grupo, Aplicação local diáriaE6795Crema, contínua7Dias, o grupo não tratado como controle biológico.

3. Avaliação farmacológica:

Função de barreira da pele: PassarASCHVaposcanMedidor de perda de água transcutâneaMedição0、3、7Perda de água durante o diaValores（TEWL）； Medir a espessura da orelha do rato diariamente com um espessométro.

ASCH VAPOSCANMedidor de perda de água transcutânea

（(c)）第3 Dia e dia7 Perda de água durante o dia (TEWL(Resultados do teste. Em comparação com o grupo de controle de solventes,E6795administração oral no7 Dia pode diminuir significativamenteTEWL. Os dados são mal representados em média ± padrão (exceto8 Grupo de administração oral diárian = 3Além dos outros gruposn = 4).* Após a correçãoP < 0,05em comparação com o grupo de controle de solventes (teste de Dunnett)

￮Detecção de comportamento de coceira: no7Dia17:00Até o dia seguinte07:00Coloque os ratos separadamente em uma gaiola de medição.2Depois de horas de período de adaptação, gravado pelo sistema de medição de arranhões12Frequência do comportamento de captura em horas.

￮Histologia e análise imunoquímica: coleta de tecido da pele da orelha de camundongos no final experimental, feita após a fixação com formaldeído e envoltura em parafina5 μmcorte, realizaçãoO H&ETinção (observação da infiltração celular inflamatória e espessura da epidermis), tintura azul metalamina (contagem de megacélulas) ePAR-2coloração imunohimico; As amostras de pele humana tambémPAR-2Testes imunosquimicos.

￮Análise de citologia de fluxo: O tecido da pele da orelha do rato foi preparado por uma suspensão de célula única por enzimologia, após a coloração com anticorpos marcados por fluorescência.FACS FortessaDetecção de acidófilos, neutrófilos,CD4⁺TA infiltração de subpopulações de células imunológicas, como células e alcalinófilos, é expressa pelo número absoluto de células por milímetro quadrado de pele da orelha.

4. Estudo farmacocinético: detecção em ratosE6795Fração livre de plasma, fração livre de sangue inteiro e sangue-Porções de celulose, avaliando suas características de absorção e distribuição em todo o corpo.

5. Análise seletiva: através de painéis seletivos de quinase eCEREPPainéis combinados de farmacologia, testes1μMe10μMConcentraçãoE6795A inibição de várias quinases, receptores e canais iónicos, avaliando sua atividade fora do alvo.

6. Análise estatística: usoGráfico Prisma 7.03Software de análise de variação de fator único (ANOVA unidirecional(combinação)DunnettMultiple testes comparativos paraα=0,05Para o nível de teste, dados em média±Erro padrão (média±SEM(Expressão.

Conclusões experimentais

1. E6795Forte e seletivo.PAR-2atividade inibidora, medição do fluxo de cálcio celular em suaIC₅₀O valor é6,56 nMSim, sim.PAR-1Sem inibição e extremamente baixa atividade off-target em uma ampla gama de painéis de quinases e farmacologia.

2. Exibição farmacocinéticaE6795Absorção oral, embora a taxa de ligação às proteínas do plasma seja elevada97.5%No entanto, uma pequena quantidade de medicamentos livres pode desempenhar um efeito terapêutico.

3. Imunoquímica confirmadaADCélulas de formação de córnea do pacientePAR-2Expressão de pessoas mais saudáveis ​​aumenta.

4. EmMC903induzido.ADNo modelo de ratos,E6795A administração oral e local pode reduzir a infiltração de acidófilos e a administração oral pode reduzirTEWLMelhorar a barreira da pele, administração local pode reduzir a espessura do ouvido.

5. EmNc / Nga ADNo modelo de ratos,2% E6795O creme pode reduzir a espessura da epidermis, a penetração de células grossas e o comportamento de rastreamento, melhorando o desempenho histológico associado à dermatite.

6. E6795Através da supressão seletivaPAR-2sinal, alvo.ADOs três núcleos da fisiopatologia (inflamação, coceira e disfunção de barreira) têm potencial como medicamentos terapêuticos locais pouco invasivos e de alto custo.