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Thermo Fisher Scientific (China) Co., Ltd
Proteomica de fosforilação ultraprofunda para avaliação seletiva de inibidores de proteína quinase
Datas:2025-08-26Leia:0
A fosforilação da proteína é uma forma comum de modificação pós-tradução das células eunucléaras e desempenha um papel importante na transmissão de sinalização celular, processos celulares e regulação da função da proteína. A fosforilação de proteínas é a transferência de grupos fosfato terminais de adenosina trifosfato (ATP) para os resíduos serina, surina e tirosina da proteína substrata através de proteína quinase. A mutação ou a expressão anormal do gene da proteína quinase provoca a hiperativação da quinase, o que desencadeia o câncer e outras doenças. Portanto, a proteína quinase tornou-se um dos alvos anti-tumorais mais importantes. Atualmente, mais de 80 inibidores de quinase (PKI) estão disponíveis no mercado em todo o mundo e cerca de 180 PKI estão em ensaios clínicos. No entanto, o desenvolvimento de medicamentos PKI ainda enfrenta muitos desafios, especialmente a seletividade de alvo e a toxicidade fora do alvo. Atualmente, a avaliação seletiva do PKI depende principalmente de centenas de proteínas quinases purificadas clonadas, ou linhas celulares com alta expressão de quinases alvo modificadas geneticamente. As quinases purificadas não podem refletir a seletividade da PKI dentro da célula devido à sua separação do ambiente celular; O teste de células transgênicas é limitado a quinases alvo pré-definidas. Respondendo a esta questão, o Laboratório Nacional de Foco de Regulação de Processos de Vida de Pequenas Moléculas do Instituto de Química Orgánica de Xangai da Academia de Ciências da China desenvolveu um método de proteômica de fosforilação ultraprofunda que realizou uma avaliação abrangente da seletividade da PKI a nível celular e proteômico.
A fosforilação de proteínas tem características altamente dinâmicas e de baixa abundância (o proteoma fosforilado representa apenas 0,1% do proteoma total, enquanto a proteína fosforilada de tirosina representa apenas 0,1-1% do proteoma fosforilado), portanto, a enriquecimento de segmentos peptídicos fosforilados se torna um passo-chave para a análise da espectroscopia de massa. Para medir com precisão os eventos de fosforilação causados pela PKI, com base em uma série de técnicas de cromatografia de coluna de afinidade global microscópica desenvolvida por eles (Anal Chem. 2020, 92, 3913-3922, J Proteome Res 2023, 22, 2450-2459, Anal. Chem. 2023, 95, 8605-8612), uma estratégia de integração de três materiais de enriquecimento de segmentos de peptídeos fosforilados seletivamente complementares foi proposta para alcançar uma cobertura completa e uma análise quantitativa imparcial dos segmentos de peptídeos fosforilados (Figura 1).
Figura 1. Esquema do processo de análise do fosforigenoma ultraprofundo e perfil dos dados da análise do fosforigenoma (clique para ver a imagem maior)
Utilizando o zebutinib como modelo, os dados de recolha de propriedades dependentes de dados (DDA) detectaram aumento significativo dos níveis de fosforilação em 25 locais de fosforilação de 25 proteínas e redução significativa dos níveis de fosforilação em 72 locais de fosforilação de 66 proteínas (com 80,9% de fosforilação de tirosina); Nos dados da coleta de espectroscopia de propriedades não dependentes (DIA), foi detectado aumento significativo dos níveis de fosforilação em 91 locais de fosforilação com 80 proteínas e redução significativa dos níveis de fosforilação em 167 proteínas (a grande maioria dos locais de fosforilação serina / surina) (Figura 2).
Figura 2. Análise proteômica de fosforilação ultraprofunda revela alterações no evento de fosforilação de linfocitos de células B causadas por zebutinib (clique para ver imagem maior)
Figura 3. Proteoquinases inibidas ou ativadas pelo zebutinib e seus processos celulares envolvidos
(Clique para ver a imagem)
A análise de enriquecimento bioinformático mostrou que, além da inibição das vias de sinalização BCR e FcR, zebutinib também regula vias de sinalização como apoptose de células B, EGFR, ERBB, RPTK e cascade MAPK (Figura 3). Curiosamente, seu estudo descobriu que zebutinib não apenas inibiu BTK e suas várias vias de sinalização críticas downstream, mas também aumentou os níveis de fosforilação das proteínas RAF1, CBL e PTPN11, ativando a regulação de feedback negativo da via de sinalização BCR mediada por ERK1/2 MAPK, bloqueando a transmissão de sinalização upstream na via de sinalização BCR. Em comparação com os alvos de zebutinib relatados na literatura, a estratégia de fosforilação proteômica ultra-profunda que eles desenvolveram permitiu obter informações mais ricas sobre o alvo (ou fora do alvo) do efeito em níveis de células vivas de uma forma de alto fluxo. Mapeando os eventos de fosforilação para as vias de sinalização celular, o mecanismo de ação do zebutinib pode ser revelado panorâmicamente (Figura 4).
Figura 4. Possíveis mecanismos farmacológicos moleculares de zebutinib revelados por proteomica de fosforilação ultraprofunda (clique para ampliar)
Em suma, a análise fosforilaproteômica ultra-profunda não só avalia a seletividade dos inibidores de proteína quinase a nível celular com alto fluxo, alta sensibilidade e alta confiança, mas também revela mecanismos de ação mais sofisticados da PKI analisando a cascade de fosforilação causada por medicamentos. Além disso, esta técnica também pode ser amplamente usada para pesquisas de transmissão de sinalização em biologia celular. O estudante de doutorado Zhang Zhang, do Instituto de Química Orgánica de Xangai da Academia de Ciências da China, foi o primeiro autor da dissertação, e o pesquisador Hao Piliang, do Instituto de Química Orgánica de Xangai da Academia de Ciências da China, foi o coautor da comunicação. Obrigado à Symantec Technologies Ltd. pela sua ajuda na análise do Astral. O trabalho foi financiado por projetos e fundos como o Fundo Nacional de Ciências Naturais, a Academia Chinesa de Ciências e o Comitê Municipal de Ciências de Xangai.