As colunas de cromatografia polimerizada ocupam um lugar importante nas áreas de cromatografia líquida (HPLC) como análise de alimentos, monitoramento ambiental e desenvolvimento de medicamentos, devido às vantagens de uma ampla gama de resistência a ácidos e álcalis, forte estabilidade química, alta resistência mecânica e complexidade da matriz aplicável. No entanto, com o aumento do uso, os poluentes na amostra (como proteínas, lípidos, matérias orgânicas fortes de retenção, etc.) serão gradualmente adsorvidos à superfície do preenchimento da coluna cromatográfica ou obstruir os orifícios, resultando em problemas como a redução do efeito da coluna, a redução da separação e a deriva do tempo de retenção. Em comparação com a substituição direta de uma nova coluna cromatográfica, o tratamento regenerativo científico restaura eficazmente o desempenho da coluna, prolonga a vida útil e reduz os custos de análise. Este sistema examina os tipos de poluição das colunas cromatográficas de polimerização, detalha os métodos de regeneração direcionados e os pontos operacionais e fornece orientação técnica para as operações de normalização do laboratório.
Princípios básicos da regeneração de colunas cromatográficas de polimerização e preparação prévia
O núcleo do tratamento de reciclagem é a eliminação dos poluentes através da escolha do sistema de solventes adequado, protegendo ao mesmo tempo a integridade do leito de coluna, sem danificar a estrutura do preenchimento polimérico (por exemplo, evitando a ruptura de ligações cruzadas e deformação do orifício). Três trabalhos fundamentais de preparação devem ser concluídos antes da regeneração: um é determinar o tipo de poluição, combinando a matriz da amostra para especular as propriedades dos poluentes, por exemplo, amostras biológicas frequentemente contêm poluentes proteicos, amostras ambientais podem permanecer com substâncias orgânicas fortemente polares; Em segundo lugar, coletar informações básicas sobre a coluna cromatográfica, consultar as instruções para confirmar o material de enchimento (por exemplo, poliestireno-dvinilbenzeno, polimetil acrilato, etc.), a faixa de resistência ao solvente e a resistência à pressão (geralmente, a coluna de polímero suporta a pressão inferior à coluna de silicone, geralmente não excede 20MPa); Terceiro, realizar testes de linha de referência de desempenho da coluna, através da determinação do número teórico de torres, separação e fatores de simetria de amostras padrão (por exemplo, amostras de mistura de benzeno), para estabelecer uma referência de contraste de desempenho antes e depois da regeneração.
Métodos de regeneração direcionados com base no tipo de poluição
A poluição da coluna de cromatografia polimerizada pode ser dividida em poluição de adsorção reversível e poluição de sedimento irreversível, de acordo com o mecanismo de interação do poluente e do recheio, a estratégia de lavagem deve ser escolhida, e os métodos de regeneração comumente usados incluem o método de lavagem gradiente, o método de lavagem de solventes específicos e o método de regeneração composta.
(1) Limpeza e regeneração de gradientes de poluição por adsorção reversível convencional
Para poluentes com força de retenção fraca a média na amostra (como a maioria dos compostos orgânicos de pequenas moléculas e algumas impurezas polares), o método de lavagem gradiente pode ser usado para aumentar gradualmente a força de lavagem do solvente e alcançar a desadesão dos poluentes. Este método é aplicável à manutenção de rotina de poluição leve diária, com as seguintes etapas operacionais específicas: primeiro lavar o volume de 10 colunas (CV) da coluna cromatográfica a uma baixa velocidade de fluxo de 0,5 ml / min com a fase de fluxo inicial (por exemplo, sistema metanol-água), removendo as amostras residuais da coluna; Em seguida, aumentando a proporção de solvente de lavagem forte em gradiente proporcional, por exemplo, a transição gradual de metanol-água (50: 50, v / v) para metanol puro (100%), mantendo a velocidade de fluxo de 0,8 mL / min para lavar 15-20 CV; se o uso de padrão de cromatografia de fase inversa e o poluente contém componentes polares, você pode lavar ainda mais 10 CV com metanol-acetonitril (50: 50, v / v) para melhorar o efeito de lavagem de poluentes não polares; Finalmente, equilibre 10-15CV com a fase de fluxo inicial até que a linha de base esteja estável. Este método tem pequenos danos ao preenchimento polimérico, e a taxa de recuperação do efeito da coluna após a regeneração geralmente pode atingir mais de 85%.
(2) Regeneração de solventes específicos com forte retenção de poluição orgânica
Quando a amostra contém hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, ácidos graxos de cadeia longa e outros materiais orgânicos fortemente retenidos, a lavagem de gradientes convencionais é difícil de remover, e é necessário usar um sistema de solventes específicos para destruir a interação hidrofóbica entre os poluentes e o enchimento. Para poliestireno-diinilbenzeno (PS-DVB) coluna de polimerização, recomenda-se a utilização de "metanol-tetrahidrofurano-metanol" método de lavagem de três etapas: primeiro lavagem com metanol puro 10CV para remover os resíduos de superfície, em seguida, com tetrahidrofurano (THF) como forte agente de lavagem, lavagem de 20-30CV a baixa velocidade de 0,3 mL / min, usando a forte capacidade de solubilidade do THF para separar os poluentes hidrofóbicos; Como o THF tem um efeito ligeiro de inflação no preenchimento polimérico, é necessário lavar posteriormente 15CV com metanol puro para encolher gradualmente o orifício do preenchimento e lavar o THF residual; Finalmente, equilibrar com o fluxo inicial. Se o poluente é uma substância polar forte (como aminocompostos), pode ser adicionado 0,1% (TFA) no sistema de lavagem, através da regulação do pH para diminuir a interação polar, mas deve notar que a concentração de TFA não deve exceder 0,5%, e após a regeneração, a solução de metanol contendo 0,05% de amônia e lavagem de 5CV, para evitar o leito de coluna de corrosão residual ácido.
(3) Enzimólise da poluição biomacolécular - regeneração composta de solventes
Após a análise de amostras biológicas (como soro, urina, extrato vegetal), as macromoléculas biológicas como proteínas, ácidos nucleicos e polysaccharides são facilmente adsorvidas à superfície do preenchimento polimerizado por hidrofobia ou ligações de hidrogênio, e até formam um poro bloqueado de sedimento em forma de gel, o efeito de lavagem de solventes simples é limitado. Neste momento, a estratégia de regeneração composta de "pré-tratamento enzimático + lavagem de solvente" é necessária: primeiro, prepare uma solução tampão contendo protease (como pancreatase, concentração de 0,1 mg / mL) (tampão de fosfato pH 7,0), enxague a coluna cromatográfica 30CV a uma velocidade de fluxo de 0,2 mL / min e deixe em reposição por 2 horas em condições de temperatura constante de 37 ° C, para que a enzima degrade completamente os poluentes proteicos; Em seguida, lavar 10CV com uma solução de água de metanol a 5% para remover o líquido enzimático residual, e depois lavar de acordo com o gradiente de ordem de "água-metanol-acetonitril-metanol", lavar 15CV em cada fase de solvente, a velocidade de fluxo é controlada em 0,5mL / min; Finalmente, lavar 5CV (inibir a proliferação microbiana) com uma solução de metanol contendo 0,01% de sodio nitrogenado e selar com metanol puro. O método de regeneração da coluna de poluição biológicaO número teórico de torres pode ser restaurado a mais de 80% dos novos pilares.
Recuperação por lavagem de sal e partículas
Quando a fase de fluxo contém sal tampão (por exemplo, fosfato, acetato de amônio) ou a amostra contém partículas em suspensão, é fácil formar cristales de análise salina ou sedimentos de partículas na entrada da coluna, causando um aumento anormal da pressão da coluna. O foco de regeneração de tais poluições é a "dissolução de baixa intensidade + lavagem física": primeiro, a coluna cromatográfica é conectada de volta (evitando que os poluentes sejam empurrados para a profundidade do leito de coluna), lavando 20CV com água ultrapura a uma baixa velocidade de 0,3 mL / min para dissolver a cristalização do sal; Se a pressão da coluna ainda é alta, você pode lavar 15CV com uma solução de água de metanol a 5%, usando a capacidade de lavagem fraca do metanol para ajudar a remover partículas; Para partículas persistentes, pode ser usado "água-metanol-água" para lavar alternadamente por 3 ciclos para descascar os sedimentos através da força de corte gerada por mudanças na viscosidade do solvente. Observe que a pressão durante a lavagem não deve exceder a coluna cromatográficaSuporta 80% da pressão e, após a regeneração, exige uma conexão positiva, equilibrada com a fase de fluxo inicial até a estabilidade da linha de base.
Considerações críticas e avaliação dos efeitos das operações de regeneração
As normas operacionais no processo de regeneração afetam diretamente o efeito de recuperação do desempenho da coluna e a vida útil, e devem seguir estritamente quatro princípios: primeiro, controlar a velocidade de fluxo e a pressão, o uso de baixa velocidade de fluxo (0,3-0,8 mL / min) durante todo o processo, para evitar que a subida súbita da pressão leve ao colapso do leito da coluna, o pico de pressão não exceda o limite superior especificado nas instruções; Em segundo lugar, para evitar a mutação do solvente, a mudança de diferentes solventes requer a transição de gradiente (por exemplo, quando o metanol muda para o THF, ajustar gradualmente a proporção em gradiente de 10%) para evitar que a mutação polar do solvente cause inchaço desigual do preenchimento; Terceiro, a proibição de solventes contra-indicados, por exemplo, cloroformo, diclorometano e outros solventes de hidrocarbonetos halogenados, a coluna PS-DVB evita o contato a longo prazo com solventes fortes alcalinos (pH > 12); O quarto é a proteção de armazenamento após a regeneração, armazenamento a curto prazo com metanol puro ou acetonitril quando não usado, armazenamento a longo prazo requer a substituição regular do solvente de armazenamento (a cada 3 meses).
A avaliação do efeito da regeneração deve ser validada por três indicadores principais: o número teórico de torres (mais de 50% de aumento em relação à regeneração), a separação (a separação de picos vizinhos retorna a mais de 1,5) e o desvio padrão relativo do tempo de retenção (RSD < 2%). Se, após várias regenerações, a separação da amostra padrão permanece abaixo de 1,0 ou a pressão da coluna continua a aumentar mais de 50% da nova coluna, isso indica que a coluna cromatográfica não está se regenerando eficazmente e precisa ser substituída por uma nova coluna.
IV. Conclusão
O efeito regenerativo das colunas cromatográficas de polimerização depende da precisão da determinação do tipo de poluição e da adequação do método de regeneração. No uso diário, deve ser estabelecido um modelo de gerenciamento de "prevenção prioritária, regeneração escalonada": reduzir a entrada de poluentes através do pré-tratamento de amostras (como filtração, extração) e realizar uma lavagem de gradiente leve de manutenção regularmente; Escolha com precisão estratégias de regeneração como enzimólise e solventes específicos para diferentes tipos de poluição e controle rigoroso dos parâmetros operacionais. O processamento de reciclagem científica não só pode reduzir significativamente os custos dos materiais de consumo de laboratório, mas também pode garantir a precisão e confiabilidade dos dados analíticos através da manutenção da estabilidade do desempenho da coluna, fornecendo um forte apoio para a execução eficiente do trabalho de análise de cromatografia líquida.