Para a entrega de genes em células difíceis de transferir, pesquisadores da Universidade Nacional de Cingapura fabricaram um sistema de entrega de genes quimerados usando a tecnologia de vesículas microcelulares (mCVT), que utilizou extrusores lipídicos da Genizer e publicou os resultados na revista Nanoscale. Nome completo original: Micro cell vesicle technology (mCVT): a novel hybrid system of gene delivery for hard-to-transfect (HTT) cells. DOI

Neste estudo, a equipe de pesquisadores da Universidade Nacional de Cingapura apresentou um novo tipo de sistema de plataforma de entrega de genes quiméricos baseado na tecnologia de vesículas microcelulares (micro Cell Vesicle Technology mCVT). Este sistema de plataforma de entrega de genes, que consiste na fusão de membranas celulares e lípidos catiônicos, é usado para melhorar a eficiência da transfecção de células HTT difíceis de transfectar. A composição da membrana celular das vesículas microcelulares confere especificidade citotonica a todo o complexo, reduzindo a citotoxicidade do complexo durante a transfecção, enquanto os lípidos catiônicos são responsáveis por se ligar ao material genético, proporcionando ao mesmo tempo integridade estrutural para os mCVTs.

Fundo

A entrega de genes é o processo de introdução de DNA estranho nas células eunucléarias. Por exemplo, a transmissão de genes terapêuticos ou funcionais para alterar o processo celular em pesquisas básicas (como descoberta de medicamentos e estudos mecânicos de proteínas funcionais) e aplicações clínicas (como terapia genética). A transferência genética eficaz requer não apenas a introdução bem sucedida de ácidos nucleicos estranhos nas células, mas também seu subsequente transporte e expressão nas células. Esta é uma tarefa desafiadora porque as próprias moléculas de DNA são carregadas negativamente e, portanto, são difíceis de internalizar pelas células em sua forma convencional. Assim, surgiu um grande interesse no desenvolvimento de sistemas eficazes de transmissão de genes. Ao longo das últimas décadas, um grande número de sistemas de veículos foram explorados, desde sistemas de entrega baseados em vírus até veículos não-vírus. Embora os veículos de entrega de genes não virais sejam relativamente ineficientes em termos de transfecção, esperam ser promissores em termos de segurança e aceitação clínica, com sistemas lipídicos catiônicos e plataformas baseadas em polímeros como principais exemplos. A Tabela 1 resume as principais vantagens e desvantagens dos reagentes ou métodos de transfecção atualmente usados.

O sistema ideal de entrega de genes não virais deve ser capaz de entregar eficazmente as moléculas de DNA necessárias para um tipo específico de célula com a mínima citotoxicidade para garantir a máxima expressão do gene alvo. No entanto, pelo que sabemos, os reagentes de transfeção comercializados atualmente claramente não atendem a esses critérios, especialmente quando são usados ​​para transfectar células difíceis de transferir (HTT).

As células HTT geralmente incluem células progenitas, células estaminais embrionárias e algumas linhagens de células perennes, como 3T3-L1 (células de gordura pré-ratos), U937 (células mononucleosas humanas), Jurkat (linfocitos T humanos), HUVEC (células endoteliais da veia umbilical humana), etc. De acordo com estatísticas, a eficiência da transfeção plasmídica de células HTT com o uso de reagentes comerciais muitas vezes não excede 25%. Uma das razões pelas quais as células HTT têm baixas taxas de absorção de substâncias estranhas e plasmídeos é sua baixa atividade metabólica. Além disso, essas células são geralmente muito sensíveis às perturbações celulares causadas pelo reagente de transfecção usado, o que pode levar a citotoxicidade e, eventualmente, à morte celular.

Recentemente, tem recebido atenção considerável devido ao potencial de sistemas de entrega de origem celular para entregar especificamente moléculas de carga ativa para o local alvo. De fato, muitos estudos exploraram o uso de sistemas de entrega de medicamentos derivados de células mononucleosas (DDS) para a entrega direcionada de medicamentos quimioterapêuticos e ADN plasmídico (pDNA) para o tumor, ou o uso de DDS derivado de glóbulos vermelhos para prolongar a circulação sanguínea e a entrega direcionada de ADN pDNA para as células sanguíneas. Especulara-se que a retenção dos componentes da membrana celular das células mães dará a esses sistemas de entrega de medicamentos baseados em células a capacidade de reconhecer células alvo específicas, possivelmente promovida por evadir a capacidade de reconhecimento do sistema imunológico do corpo.

Apesar da importância terapêutica significativa, todo o potencial do DDS baseado em células na transmissão de genes ainda não foi desenvolvido até agora. Os principais desafios que precisam ser resolvidos incluem os processos de separação / produção onerosos e de baixo fluxo de DDS de origem celular (como formas de exossomas) e técnicas de carga genética / composta subótimas. Assim, embora esses sistemas pareçam ter vantagens em termos de direcionamento intrinseco, eles têm grandes limitações em termos de rendimento e eficiência de carga de pDNA. Portanto, para superar essas limitações, proponemos aqui o desenvolvimento de um novo tipo de sistema de entrega de genes quiméricos, composto por componentes de membrana celular e componentes de lípidos catiônicos, o primeiro para aumentar a internalização das células alvo e o último para aumentar a carga do pDNA.

Neste estudo, descrevemos o desenvolvimento da tecnologia de vesículas microcelulares (mCVTs), uma nova plataforma de entrega híbrida obtida através da fusão de lípidos catiônicos com membranas celulares. Para produzir mCVTs, as células são tratadas primeiro com uma solução de baixa permeabilidade para obter células fantasmas (CG sem citoplasma em células orgânicas), como descrito por Goh et al. A solução de baixa osmose forma uma abertura curta na membrana plasmática, permitindo a limpeza do conteúdo dentro da célula, mantendo a integridade da membrana plasmática. CG de diferentes células suspensas em meio aquático foi usado para hidratar a película lipídica DOTAP seca e, em seguida, extrudido através de um extrusor lipósomo, fornecendo mCVTs com tamanho fluidomecânico médio semelhante ao lipósomo DOTAP extrudido e potencial Zeta. Neste estudo, demonstramos que os mCVTs são capazes de se combinar com os plasmódios e serem internalizados pelas células alvo, com a menor toxicidade celular. Curiosamente, quando os mCVTs produzidos a partir de diferentes tipos celulares foram comparados in vitro, eles mostraram uma eficiência significativamente maior de transfeção para o tipo de célula de origem dos mCVTs.

Métodos e resultados

Preparar células fantasma (CG sem citoplasma e membrana celular orgânica) para garantir a repetibilidade e segurança de mCVTs.

Métodos e resultados pouco

Análise de produção e características de mCVTs.

De forma semelhante à produção de liposomas, o método de película lipídica é usado para produzir mCVTs. A película DOTAP é hidratada com o CG para formar um grande liposoma polimolecular envolvendo o CG. Esta suspensão é extruida e a membrana de plasma do CG contém o lípido DOTAP (como mostrado na Figura 3A). De acordo com a metodologia estabelecida anteriormente por nossa equipe, foi demonstrado que, após a extrusão, os mCVTs resultantes são compostos pela fusão de lipídios e membranas CG. Em geral, a distribuição de tamanho do mCVT é semelhante ao dos liposomas. Para demonstrar a robustez e versatilidade deste método em várias linhagens celulares, mCVTs foram produzidos usando CG de diferentes linhagens celulares, como algumas células HTT (ou seja, 3T3-L1) e células não cancerosas (ou seja, HEK293 e RAW264.7). Como mostrado na Figura 3B, os tamanhos e PDIs de fluidos mecânicos de vários mCVTs são geralmente na faixa de 400 nm (PDI ~ 0,4), semelhantes aos liposomas DOTAP produzidos usando o mesmo método de extrusão (PDI ~ 0,2). Na Figura 3C, diferentes fórmulas observaram valores de potencial zeta semelhantes (cerca de +30 mV a +40 mV), sugerindo que este método é geralmente aplicável a CG produzida a partir de linhas celulares diferentes. Curiosamente, quando o mCVT3T3-L1 se replica com o pDNA, sua distribuição de tamanho é semelhante à dos mCVTs não replicados, e o potencial zeta global se torna negativo, o que pode indicar o sucesso da replicação (porque o pDNA carregado negativamente neutraliza os mCVTs carregados positivamente).

A. Esquema de mCVTs envolvendo a fusão de liposomas feitos de fantasmas celulares e filmes finas de hidratação.

Dimensões hidrodinâmicas de diferentes mCVTs e mCVT3T3-L1 com plasmídeos em comparação com liposomas DOTAP. Todos os mCVTs têm tamanhos inferiores a 500 nanômetros.

C. Potenciais Zeta de mCVTs diferentes e mCVT3T3-L1 com plasmídeos em comparação com liposomas DOTAP. Todos os mCVTs têm um potencial Zeta acima de +30 mV, exceto o mCVT3T3-L1 com DNA plasmódico (5 µg), que apresenta um potencial Zeta negativo devido à interação com o DNA plasmódico. Os dados representam a média ± SD (n = 3).