Método de contagem celular：Da placa de contagem ao contador de células totalmente automático

Muitos experimentos e testes comuns exigem que os cientistas primeiro calculem com precisão o número ou a densidade das células. Essas operações incluem a manutenção de culturas celulares simples (como transmissão celular) e experimentos quantitativos (como qPCR). A contagem de células pode ser realizada por vários métodos, e este artigo apresentará detalhadamente esses métodos e suas vantagens e desvantagens.

1 Placa de contagem / células sanguíneasContagemAparelho

Utilização de células sanguíneasContagemAparelhoLimpe primeiro com 70% de álcool e papel da lente.ContagemAparelhoEm seguida, coloque a tampa suavemente na placa de contagem. Se a capa for colocada corretamente, o fenômeno do anel de Newton (padrão colorido em forma de anel concêntrico) pode ser observado. Pegue uma pequena parte da suspensão celular com um pipete e coloque o pipete na borda da placa de contagem para que a suspensão flua para a câmara de contagem através da capilação. Se a atividade celular for necessária para ser detectada, o azul de tapão deve ser misturado na suspensão celular em proporção 1: 1 antes de ser adicionado à sala de contagem.

Células sanguíneasContagemAparelhoFoi um método inicial dedicado a obter contagens de células precisas, com uma grade especial na placa de contagem. Normalmente, os quadrados grandes são de 1 mm x 1 mm e são divididos em pequenos quadrados de 0,05 mm x 0,05 mm. A borda da câmara de contagem é projetada para fixar o slide da tampa a 0,1 mm acima da grade de marcação, formando assim uma área de volume conhecido.

Após o uso do microscópio focado em uma área da sala de contagemContadorContar as células. Geralmente, uma área de 1 milímetro quadrado (100 nanolitros) é usada e 4 ou 10 vezes a contagem do objetivo é usada, mas a escolha específica depende do tamanho da célula e da densidade na suspensão. Este processo é geralmente repetido em quatro áreas diferentes de 1 mm quadrado, o resultado é a média. Se a atividade celular for detectada, as células vivas e as células mortas devem ser contadas, respectivamente, onde as células mortas são tingidas de azul devido a danos na membrana.

Figura 1 SangueCélulasEsquema da grade da placa de contagem

Vantagens e desvantagens

A contagem manual é uma forma de economizar orçamento, mas também é a mais demorada e pesada. A confiabilidade é baixa devido a erros humanos, especialmente quando várias contagens são feitas de forma contínua. Além disso, contagens frequentes também podem causar fadiga ocular. Se o laboratório precisar contar apenas ocasionalmente e não precisar de alta precisão, as células sanguíneasContadorÉ uma boa escolha. No entanto, essa abordagem parece insuficiente quando é necessária uma contagem frequente, uma maior precisão ou aplicações de alto fluxo. Além disso, é difícil distinguir diferentes tipos de células na suspensão com contagem manual, a menos que o tipo de célula difera significativamente em tamanho ou forma.

2 Células AutomáticasContador

Células AutomáticasContadorÉ uma alternativa rápida, fácil e automatizada à contagem manual. Eles são baseados em células sanguíneas.ContadorO mesmo princípio é feito contando as células várias vezes dentro de uma área conhecida e tomando a média. Estes dispositivos também podem distinguir entre células vivas e mortas por meio da eliminação de tintores, como o azul de taipão. Células AutomáticasContadorPode ser um dispositivo independente ou conectado a um computador. A maioriaContadorAlém de fornecer a contagem de células, também é possível contar informações como o tamanho das células.

Contagem de células fluorescentesInstrumentação(Por exemplo, Luna-FL) ™ Contagem de células duplas fluorescentesInstrumentaçãoAs células vivas e mortas podem ser diferenciadas e a contagem celular é feita usando cromatizantes comuns, como laranja de pipidina e iodeto de propidina. Esses tipos de contagem celularInstrumentaçãoTambém é excelente na contagem de células em culturas que podem ser contaminadas por fragmentos não celulares, como células originais, porque os corantes podem distinguir claramente as células.

Vantagens e desvantagens

automáticoContadoradequadogeralContagem celular e detecção de atividade. É simples de operar e de baixo custo, reduzindo significativamente a quantidade de trabalho para a contagem manual. automáticoContadorÉ preciso e confiável, mas pode ser um desafio quando a contagem é irregular, muito pequena, a suspensão é extremamente fina ou contém uma variedade de células que precisam ser diferenciadas. Para a maioria dos tipos de células e aplicações, automaticamenteContadorFornece um desempenho de contagem eficiente.

3 CoulterContador

CoulterContadorNão é um instrumento óptico, mas sim a contagem das células medindo as mudanças de resistência nos microcanais. A resistência da célula é maior do que a solução de eletrólito em suspensão e aumenta brevemente quando a célula passa pelo canal, uma mudança que aumenta com o aumento do tamanho da célula. CoulterContadorOperação semelhante à automáticaContadorNo entanto, o teste de vazio deve ser executado antes do uso e o dispositivo deve ser lavado após o uso.

Vantagens e desvantagens

KurtContadorÉ rápido e precisa para contar células de diferentes tamanhos, por isso é frequentemente usado para contagem de células sanguíneas em hospitais. No entanto, ele não é capaz de distinguir entre células vivas e mortas, nem é capaz de contar com precisão as células que formam agrupamentos. Além disso, os requisitos de manutenção são elevados.

4 Celulômetro de fluxo

Os citometros de fluxo são geralmente usados ​​para análises celulares mais detalhadas, equipados com técnicas de detecção de fluorescência para detectar componentes intracelulares marcados. Nem todos os citometros de fluxo são capazes de realizar contagens celulares, mas os citometros de fluxo com capacidade de medição de volume fornecem contagens celulares altamente precisas e distinguem os tipos de células por anticorpos marcados por fluorescência.

Vantagens e desvantagens

Os citometros de fluxo são poderosos, mas caros, geralmente entre US $ 40.000 e US $ 100.000 ou mais, e, portanto, raramente são usados ​​para contagens celulares convencionais.

5 Outros métodos de contagem celular

Espectrometria ocasionalmente usada para estimar a densidade celulargraus. Devido à turbididade das células, a luz através da placa de viscera diminui à medida que a densidade das células aumenta. No entanto, como o espectrómetro não conta as células diretamente e mede apenas a absorção, e outras variáveis ​​na suspensão podem afetar a absorção, este método não é confiável.

O método de cultura é outro método de contagem que é aplicável apenas às células que formam colônias (por exemplo, bactérias). Depois que a suspensão celular é diluída e delineada no prato de Petri, o número de colônias é contado para calcular a densidade celular da suspensão original. Mas devido à necessidade de esperar para que as colônias cresçam, o método de cultivo é o mais lento.

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