Instruções para uso experimental do kit ELISA do fator de crescimento endotelial humano A (VEGF-A)

BS-9809 Kit de ELISA do fator de crescimento endotelial humano A (VEGF-A)

I. Visão geral do produto

Este kit de teste usa o método de imunoassorção ligado a centrinsas bicorpais (ELISA) para detectar as concentrações de VEGF-A em soro humano, plasma, homoplasma de tecidos, soro superior de cultura celular e outras amostras. Apenas para uso científico.

II. Composição da caixa

Pré-embalado em placas microporosas: 12 buracos x 8 (especificação de 96 buracos) ou 12 buracos x 4 (especificação de 48 buracos), pré-embalado com anticorpos anti-VEGF-A capturados.

Produto padrão: pó congelado e seco, é necessário diluir o líquido de diluição padrão após a disolução (gradientes de concentração recomendados: 10, 3,33, 1,11, 0,37, 0,12, 0,04, 0 ng / mL).

Detecção de anticorpos-HRP: anticorpos anti-VEGF-A marcados com a peroxidase da raiz moringa.

Tampon de lavagem: 20 x concentrado, diluído com água destilada a pressão de 1:20.

Solução de substrato: TMB coloridor A / B, misturar 1: 1 antes de usar, dentro de 15 minutos.

Solução final: 2M.

Liquido de diluição de amostras: usado para diluir amostras de alta concentração.

Membrana de vedação: 2 folhas para selar a placa microporosa durante a criação térmica.

III. Princípios experimentais

O VEGF-A se liga ao anticorpo pré-embalado capturado, formando um complexo "anticorpo-antígeno"; Após a adição do marcador HRP para detectar anticorpos, a "estrutura de clamp" é formada. Depois de lavar, remover a substância não ligada, adicionar a cor do substrato TMB (azul), o líquido de terminação torna-se amarelo após terminar a reação. O comprimento de onda de 450 nm determina a absorção (valor de OD), a concentração é proporcional ao valor de OD.

IV. Passos experimentais

Preparação da amostra

Soro / Plasma: remoção centrífuga das partículas para evitar hemolisis; 2-8 ℃ conservação ≤ 48 horas, a conservação a longo prazo precisa de -20 ℃ / -80 ℃ (evitar o congelamento repetido).

Limpeza celular: remoção centrífuga para evitar altas concentrações de proteases.

Preparação do Reagente

Liquido de lavagem: quando o líquido de lavagem concentrado é cristalizado a temperatura ambiente, dilua a pressão de 1:20 depois de um banho de água de 40 ° C ser dissolvido.

Produto padrão: diluído após a dissolução, agora disponível.

Substrato: TMB A / B líquido 1: 1 misturado para conservação à luz.

Processo operacional

Amostragem: Adicionar 100 μL padrão / amostra por poço e incubar a 37 ° C por 90 minutos.

Lavagem: deixe o líquido dentro do buraco seco, mergulhe com o líquido de lavagem por 1 minuto / vez, repita 3 vezes.

Adicione anticorpos de detecção: Adicione 100 μL de anticorpos marcados por HRP a cada poço e incube a 37 ° C por 60 minutos.

Lavagem: passo 2.

Coloração: Adicione 90 μL de substrato TMB a cada orifício e incube à luz a 37 ° C por 15-20 minutos.

Terminação: Adicione 100 μL de terminação a cada poço e medir o OD dentro de 30 minutos após a mistura.

Resultado do cálculo

Usando a concentração padrão (ng/mL) como coordenada horizontal, o valor OD desenha a curva padrão para as coordenadas longitudinais.

Calcule a concentração de acordo com a curva de substituição do valor de OD da amostra e multiplique o múltiplo de diluição para obter o resultado.

V. Atenção

Conservação do reagente: a caixa de reagente não usada precisa ser conservada a 2-8 ° C, com validade de 6 meses; Os produtos padrão solúveis podem ser congelados em parcelas para evitar derretimento repetido.

Tratamento de amostras: Evite usar amostras contidas para impedir a atividade da HRP.

Especificações operacionais: pipeta necessária para evitar bolhas; A lavagem é necessária para evitar a contaminação cruzada.

Proteção de segurança: o líquido de terminação contém ácido forte, é necessário usar luvas para operar.

VI. Resultados esperados

Sensibilidade: ≤1,54 pg/mL (de acordo com as instruções).

A faixa típica é de 3,12-200 pg/mL, com alguns kits expandidos para 62,5-2000 pg/mL.

Repetibilidade: coeficientes de variação intra-placa/inter-placa <10% e <15%, respectivamente.

7. Perguntas frequentes

P: Claro demais ou profundo demais?

A: Ajustar o múltiplo de diluição da amostra ou o tempo de incubação; Certifique-se de que a substância é fresca.

P: Desordem linear da curva padrão?

A: Verifique a operação de dissolução para evitar bolhas; Troque a cabeça do pipete.

Nota: Este produto é apenas para uso de pesquisa científica, não como dados reais, o experimento deve seguir estritamente as instruções ou consultar um professor técnico.

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