Instruções técnicas do kit de teste ELISA para interferon gamma humano (IFN-γ)

BS-0033 Kit de ELISA para interferência gamma humana (IFN-γ)

I. Princípio de teste

Esta caixa de testes utiliza um teste de imunoassorção ligado a centrifase bicorpal (ELISA). Anticorpos monoclonais anti-IFN-gamma humanos são pré-embalados em placas microporosas, adicionando amostras, produtos padrão e anticorpos de detecção marcados por biotina para formar um complexo anticorpo-antígeno-enzima. Após a lavagem, a ligação de Streptavidin-HRP marcada por peroxidase de raiz de moringa é adicionada e colorida através do substrato TMB. A clareza da cor foi positivamente associada à concentração de IFN-γ na amostra e a absorção (OD) foi avaliada quantitativamente usando um escalómetro enzimático.

II. Composição da caixa

Componente Configuração de 96 buracos Configuração de 48 buracos Condições de armazenamento

Placa pré-embalada com microporos 12 buracos x 8 barras 12 buracos x 4 barras 2-8 ℃

Produto padrão para secagem por congelamento 1 tubo 1 tubo 2-8 ℃ (-20 ℃ após a dissolução)

Anticorpos marcados com biotina 100μL 100μL 2-8 ℃ (proteção contra a luz)

Hormones de molho em cadeia-HRP 100μL 100μL 2-8 ℃ (proteção contra a luz)

Diluído da amostra 30mL 15mL 2-8 ℃

20 x tampão de lavagem 20mL 10mL 2-8 ℃

TMB Substrato Liquido 10mL 5mL 2-8 ℃ Proteção contra a luz

Liquido final 10mL 5mL 2-8 ℃

Folha de vedação 4 folhas 2 folhas Temperatura ambiente

Requisitos de amostra

1. Tipo de amostra

Soro / Plasma: Use EDTA ou hepatina anticoagulante para evitar hemolisis.

A cultura celular é limpa: a centrifugação elimina as partículas para evitar o congelamento repetido.

Outros líquidos biológicos: tais como líquido cerebrospinal, água torácica e abdominal, precisam ser esclarecidos após o teste.

2. Tratamento de amostras

Proporção de diluição: o soro / plasma é recomendado para diluição 1: 5 (amostra: diluído = 1: 4), o soro celular é recomendado para diluição 1: 2.

Condições de conservação: conservação a curto prazo (≤7 dias) 2-8 ° C, a longo prazo deve ser congelado em parcelas a -80 ° C (para evitar o congelamento repetido).

IV. Passos experimentais

1. Preparação do Reagente

Liquido de lavagem: dilua o concentrado 20 x com água destilada para 1 x líquido de trabalho (por exemplo, 20 ml de concentrado + 380 ml de água).

Solução padrão: O produto padrão para liofilização é adicionado a 1 mL de diluição padrão, deixe em reposo por 15 minutos e prepare uma alta concentração de líquido mãe.

Dilução em gradiente: Tome 7 tubos EP, adicionar 500 μL de diluição a cada tubo, transferir 500 μL da líquida mãe para um tubo e misturar, em seguida, diluir em proporção (exemplo: 1000 → 500 → 250 → 125 → 62,5 → 31,25 → 15,625 pg / mL).

2. Amostragem e temperação

Adicione 100 μL de produto padrão ou amostra diluída a cada poço (teste de pós-poço recomendado).

37 ° C de proteção contra a luz durante 90 minutos, selando a membrana da placa.

3. Lavagem

Tire todo o líquido dentro do buraco, lave 3 vezes com 1 x líquido de lavagem, mergulhe por 1 minuto cada vez e seque.

4. Visualização e Terminação

Adicione 100 μL de anticorpos marcados com biotina a cada poço (diluído com anticorpos 1: 100 com diluição antecipada) e mantenha a temperatura à luz a 37 ° C por 60 minutos.

Após a lavagem, cada poço é adicionado 100 μL de molho de cadeia-HRP (diluído antecipadamente com diluído ABC 1: 100), 37 ° C de proteção contra a luz durante 30 minutos.

Após a lavagem, adicionar 100 μL de substância TMB a cada orifício, 37 ° C de proteção contra a luz durante 15-20 minutos.

Adicione 50 μL de terminante a cada poço para terminar a reação (a solução passa de azul a amarelo).

5. Determinação

Medir o OD de comprimento de onda de 450 nm (comprimento de onda de referência 570-630 nm) em 30 minutos com um calibrador enzimático.

V. Resultado do cálculo

Usando a concentração padrão como coordenada horizontal, o valor OD desenha a curva padrão para a coordenada longitudinal (ajuste de quatro parâmetros).

De acordo com o valor de OD da amostra, a concentração real é calculada pela equação de regressão, se a diluição da amostra for necessária para ser multiplicada pelo múltiplo de diluição.

Indicadores de desempenho

Parâmetros Indicadores

Sensibilidade ≤1.0 pg/mL

Faixa de detecção 15,63-1000 pg/mL

Precisão CV dentro da placa <10%

Taxa de recuperação 83%-113%

Especificação Sem reação cruzada com IL-2, IL-4, etc.

VII. Atenção

Conservação do reagente: placas não usadas devem ser seladas e mantidas a 2-8 ° C para evitar a umidade; O líquido de substrato TMB precisa ser protegido da luz.

Tratamento de amostras: evitar o uso de amostras hiperlipídicas e hemolíticas; As amostras de alta concentração requerem pré-experimento para determinar o múltiplo de diluição.

Especificações operacionais:

Evite bolhas durante a amostragem e a cabeça da arma deve ser substituída.

O tempo de temperação é estritamente controlado dentro dos limites prescritos para evitar a evaporação.

Controle de qualidade: cada lote de experimentos requer um buraco em branco (S0) e um controle negativo.

Dica de segurança: terminar o ácido líquido, é necessário usar luvas para operar; Os resíduos são tratados de acordo com os perigos biológicos.

VIII. Período de validade

O kit é válido por 6 meses a 2-8 ° C, e o produto padrão é recomendado para congelar a -20 ° C após o desmantelamento.

Nota: Este produto é apenas para uso de pesquisa científica, não como dados reais, o experimento deve seguir estritamente as instruções ou consultar um professor técnico.

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