Resumo: A ingestão de glicose pela bactéria Bacillus glutamatus é principalmente através do sistema de transferase de glicose fosfato (PTS) com alta afinidade à glicose (Km = 0,35 mM). Selecionando mutantes que suportam a 2-desoxiglicose (2DG) e a ausência de atividade de transporte de glicose dependente da PEP, estes mutantes são capazes de crescer em meios com a glicose como fonte única de carbono e energia, a ingestão de açúcar é significativamente reduzida devido ao uso de um sistema de ingestão não PTS com baixa afinidade (Ks = 11 mM). Crescendo em meios com diferentes pressões de penetração, as células de tipo selvagem têm taxas de consumo de glicose e taxas de crescimento mais baixas do que. As células dessas culturas mostraram ter atividade PTS semelhante quando medidas em condições padrão. No entanto, quando as células foram ressuspendidas em tampões com diferentes pressões de penetração, a atividade do PTS mostrou-se associada à pressão de penetração. Este efeito inibidor pode explicar a diminuição da taxa de absorção e crescimento de açúcar observada em meios de fermentação de pressão de alta penetração. No entanto, os sistemas de transporte de glicose não PTS não são afetados pela pressão de penetração do meio de cultura. Uma inibição semelhante da capacidade de transporte de açúcar foi observada em condições de produção industrial com o aumento correspondente da pressão de penetração do meio de acumulação de glutate. Este fenômeno limita o processo de fermentação, uma vez que a diminuição da taxa de relação leva a um aumento da proporção de açúcar consumido para a manutenção da célula, acompanhado de uma redução da produtividade do produto.

Palavras-chave: transporte de glucose; pressão de penetração; fermentação de ácido glutânico; Bactérias bactérias glutamatas;

Conteúdo da pesquisa:

Efeito da pressão de penetração na vitalidade do sistema de absorção de glicose PTS

A atividade do PTS permanece constante dentro de uma pressão de penetração de 800 mOsmol / kg, depois que a atividade do PTS diminui linearmente com o aumento da pressão de penetração. A atividade do PTS é de apenas 15% quando a pressão de penetração é de 1900mOsmol/kg.

Efeito da pressão de penetração na fermentação de glutácido

A acumulação de glutácido e submetabólicos provoca um aumento significativo da pressão de penetração do meio de cultura, e para manter o pH constante, a adição de álcalis (neste caso, amônia) intensifica ainda mais o aumento da pressão de penetração. Este fenômeno foi observado na cepa sensível à temperatura 2262 de Bacillus glutamatus, que é capaz de alcançar altas concentrações de produto (glutamato > 85 g / L) e pressões de penetração superiores a 2000 mOsmol·kg-1. A taxa de consumo de açúcar permanece inalterada nas primeiras horas.

diminuindo gradualmente. Para verificar se o enfraquecimento da atividade está associado ao aumento da pressão de penetração causado pela acumulação de glutácido, a contribuição da atividade do PTS para a ingestão total de açúcar foi medida com a contribuição consistente medida em Bacillus glutamatus ATCC17965, ou seja, 4,5 mmol.g-1·h-1. Nas cepas produtoras de glutamato, a ingestão total de açúcar foi mais rápida, indicando maior atividade da penetrase. As taxas de ingestão de glicose medidas em condições não coercitivas indicam que a penetransa contribui com até 25% da ingestão total de glicose em Bacillus glutamatus 2262. Para medir o efeito inibitório do estresse de penetração sobre a atividade do PTS de acordo com a medição in vitro do sistema de transporte do PTS, a redução do consumo de glicose pode ser observada muito próxima da redução prevista da atividade do PTS em condições de suplemento de glicose (contribuição da penetrase é negligente) (baixa concentração de glicose residual, ou seja, menor que 2g·l-1) (Figura 3a). Quando a estratégia de suplemento de glicose é adotada para manter concentrações mais altas (50 g·l-1), a melhoria do consumo de glicose pode ser devido à atividade da penetrase e à alta saturação do sistema com a glicose presente no reator (Figura 3b). Nestas condições, a alta taxa de consumo de glicose leva ao aparecimento precoce de metabólitos adicionais, como o ácido láctico.

Efeitos na produção de glutate

Uma das consequências da diminuição da atividade metabólica, uma vez que a pressão de penetração no meio é aumentada, é a redução significativa da produção de glutate no final da fermentação. A diminuição do consumo de glicose provoca uma diminuição da produção de glutamato, devido ao aumento da proporção de glicose convertida em CO2. A produção de CO2 permanece aproximadamente constante durante toda a fase de produção, o que sugere que a necessidade de obter energia bioquímica do metabolismo do açúcar para atender à manutenção celular é constante, proporcional à biomassa dentro do tanque de fermentação.

Assim, a redução da taxa de açúcar em relação ao consumo requer um aumento da proporção de açúcar consumido. Quando calculado usando um coeficiente de manutenção de 0,6 mmol de glicose/g de células/h de Bacillus glutamatus, a proporção de glicose necessária para a manutenção da célula aumentou de 15% do consumo total de açúcar na fase inicial da produção de glutamato para 40% quando a pressão de penetração pós-fermentação é máxima (Figura 4). A redução da produção de glutácido observada no final da fermentação é consistente com as mudanças no fluxo metabólico de carbono para manter a demanda. Dependendo da redução da necessidade metabólica de oxigênio durante a atividade metabólica enfraquecida, o controle das concentrações de açúcar residual com base nas mudanças de oxigênio pode restaurar uma perda parcial de rendimento.

4. Discussão

Este artigo ilustra que a inibição posterior da fermentação de glutáceo está diretamente relacionada com o efeito controlador da acumulação de produtos e do ambiente de penetração na capacidade de absorção de açúcar. Este fenômeno não é devido a mudanças nos níveis de expressão genética, mas sim a mudanças na atividade bioquímica do sistema de transporte sob condições de força de penetração. Além disso, este efeito é reversível porque, uma vez que a força de penetração é eliminada, as células lavadas ainda podem recuperar sua capacidade de transportar açúcar. Da mesma forma, a capacidade de transferência de açúcar das células de crescimento normal também foi significativamente reduzida quando resuspendida em tampão altamente osmoso. À medida que a pressão de penetração aumenta, esse efeito fisiológico resulta em uma diminuição da capacidade de consumo de açúcar e uma diminuição da taxa metabólica. Como as necessidades energéticas para manter a biomassa permanecem inalteradas e, em muitos casos, é necessário adicionar energia adicional para satisfazer essa pressão, isso também levará a uma redução da produtividade do produto. O consumo crescente de açúcar será usado para a produção de energia e, portanto, será perdido na forma de dióxido de carbono à custa da redução dos produtos. Para a fermentação de glutáceo, com o aumento da pressão de penetração do meio, o rendimento e a taxa de produção diminuem significativamente. O mecanismo bioquímico que desencadeia a diminuição da capacidade de transporte da proteína PTS ainda está por determinar, mas pode estar associado a mudanças estruturais no complexo proteína/membrana. As cepas que produzem glutame de forma mais eficiente ou mais rápida chegarão ao limiar de penetração mais rápido, o que levará a uma possível melhoria do rendimento após 24 horas de fermentação. Portanto, a triagem de cepas com alta resistência à pressão é benéfica para a fermentação, garantindo assim que as cepas industriais sejam suficientemente robustas para manter uma alta atividade metabólica ao obter um alto rendimento de produto. Outro caminho para superar essa supressão metabólica é o desenvolvimento de um sistema de fermentação capaz de integrar o processo de extração downstream para remover o produto quando a fermentação se acumula.